аЯрЁБс>ўџ 68ўџџџ5џџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџьЅС5@ №П$$bjbjЯ2Я2 "(­X­X џџџџџџˆ2222222FЊЊЊЊОFд ЖоооооННН  $Š Rм І1 ]2НЙННН1 22оолŽ чччНІ2о2о чН ччƒ 22Я ов €N2owйФЊc@›  Є 0д Ѓ ,‚Ѓ:‚Я FF2222‚2Я <ННчННННН1 1 FFdЊн FFЊPreparing frozen stock of competent DH5a№ cells. Streak cells from the frozen stock on LB plate without antibiotic. Incubate overnight at 37(C. Transfer 4 or 5 well-isolated colonies into 1ml LB containing 20mM MgSO4, vortex and dilute in 30-100ml of LB with 20mM MgSO4 in a 1-liter flask. Grow cells for 2.5-3 hrs at 37(C to the OD600 ~0.4-0.5. Transfer the cells to sterile, ice-cold centrifuge tube (for SS-34 Sorvall rotor), cool for 10min in ice-water bath. Spin the cells for 5min at 2000g. Decant the media from the cell pellets. Stand the tubes in inverted position to allow last traces of media to drain away. Resuspend the cells by swirling and gentle vortexing in 20ml ice-cold FSB buffer*. Spin the cells for 5min at 2000g. Decant the media from the cell pellets. Stand the tubes in inverted position to allow last traces of buffer to drain away. Resuspend the cells by swirling and gentle vortexing in 4ml ice-cold FSB buffer. Add 140m№l of DMSO per 4ml of resuspended cells. Mix gently by swirling and store the suspension on ice for 15min. Add an additional140m№l of DMSO to each suspension. Mix gently by swirling and return to ice bath. Working quickly, dispense 25m№l aliquots of the suspensions into chilled, sterile eppendorf tubes. Immediately snap-freeze the cells in liquid nitrogen. Store the cells in -70(C. When needed, remove the cells from the freezer, thaw by holding the tube in the palm of your hand. Just as cells thaw, transfer the tube on ice and let stand for 10min. Use 0.5ng of supercoiled DNA to transform 25m№l of cells. Preparation of 1L of FSB. Reagent Amount required/liter Final concentration 1M Potassium acetate pH7.5 10ml 10mM MnCl2 x 4H2O NP^bфј   Ў А В Д   ! " @ A L O Y Z [ Ќ Ю п ф ъ ё ђ l m П Р Z \ j l >@hj<>0ѓуѓкгЯЫЯФЯМгЫЯМЗгЯЌЯФЯМЯЫЁЫЫЫ’ЁЁЁŽƒŽŽƒŽƒŽГѓДЪБеЗЁГѓДЪБеЗЁАПДГВЯДГГѓДЪБеЗЁГѓЗ(§ГѓВт<іCJaJhЗ(§hЗ(§hЗ(§CJaJhy<іhy<іCJaJ hy<іH*hy<іhy<іH* jА№hy<іhЗXДhy<і hy<іhy<іhy<і5CJ(aJ(hy<іhy<і5CJ(OJQJaJ(hy<іhy<і5CJ(aJ(0`b " [ ђ m Р К \ @4PRЪŒP"дЂЄT!§§ѕѕѕѕѕѕэээхээррррррррррррgd`4D & Fgd~]E & FgdЗ(§ & Fgdy<і$$§01PRˆЊЖтPfrвдор(6”–ž ЂЄюќТаp~@NЈЬ  6 L L!N!R!T!D"##Š#Œ#"$$$љѕёцёѕёквЫёЧЫёЫёЧёПёПёНёЧёПёЫёПёЧёЧёЧёЧёЫЙёЫёЙВЙёЙЎЃЎœЎ• h`4DhrЕ jА№hЧoНhЧoНhЧoНOJQJhЧoН jА№hrЕhrЕUh`4Dh`4DH*hс_в h`4Dh`4Dh`4DCJ aJ hЧoНh`4D5CJ aJ h~]Eh`4DOJQJh`4Dh~]E jА№h~]E8 8.91g 45mM CaCl2 x 2 H2O 1.47g 10mM KCl 7.46g 100mM Hexaamminecobalt chloride 0.80g 3mM Glycerol 100ml 10% 1M Potassium acetate is prepared by dissolving 9.82g of potassium acetate in 90ml of Milli-Q water and adjusting pH to7.5 with 2M acetic acid and then bringing the volume to 100ml. 10ml aliquots are stored at -20(C. Prepare the FSB by mixing all the components with 800ml of Milli-Q water and adjusting pH to 6.4 with 0.1N HCl. Do not add base if overshoot  discard and start over. Bring the volume to 1 liter, filter the FSB through 0.45m№m filter to sterilize. 40ml aliquots should be stored at 4(C. During the storage, the pH will drift to 6.1-6.2 and then will stabilize T!$$і„0§]„0§gdЧoН 1hАа/ Ар=!А"А# $ %Аœ@@ёџ@ NormalCJ_HaJmH sH tH DA@ђџЁD Default Paragraph FontRi@ѓџГR  Table Normalі4ж l4жaі (k@єџС(No List (џџџџ01"[ђmР]Ў ‚412—юOБsклГ  ˜0€€€˜0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0€€€˜ 0 €€€˜ 0 €€€˜ 0 €€€˜0€€˜0€€p˜0€€p˜0€€€˜0€€ €˜0€€ €˜0€€ €˜0€€ €˜0€€€˜0€€˜0€€ €˜0€€ €˜0€€ €0$$ T!$$ $$ №8№@ёџџџ€€€ї№’№№0№( № №№B №S №ПЫџ ?№ žЅmv˜Ё]fˆ‘ЫжгмъѕБД*0 5 я є  "  /‚›0Бq w  3333t4Бsл  џџsvetal995ж*–Јqџџџџџџџџџ „а„˜ўЦа^„а`„˜ў5CJo(.€ „ „˜ўЦ ^„ `„˜ў‡hˆH.‚ „p„LџЦp^„p`„Lџ‡hˆH.€ „@ „˜ўЦ@ ^„@ `„˜ў‡hˆH.€ „„˜ўЦ^„`„˜ў‡hˆH.‚ „р„LџЦр^„р`„Lџ‡hˆH.€ „А„˜ўЦА^„А`„˜ў‡hˆH.€ „€„˜ўЦ€^„€`„˜ў‡hˆH.‚ „P„LџЦP^„P`„Lџ‡hˆH.5жџџџџџџџџЖA ’         х`4D~]EЗXДrЕЧoНewНс_вy<іЗ(§џ@€ъъш“ŒђђъъX   ``@` `` @``џџUnknownџџџџџџџџџџџџG‡z €џTimes New Roman5€Symbol3& ‡z €џArial"qˆ№аhšŒІтŒІсŒІDЈs Јs $№ ДД24d   3ƒQ№H)№џ?фџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџy<іџџ.Preparing frozen stock of competent DH5a№ cellssvetal99svetal99 ўџр…ŸђљOhЋ‘+'Гй0А˜ мшќ$ 8D ` l x „˜ Јщ§1Preparing frozen stock of competent DH5яЁ cellsprep svetal99 frvetvetNormal9 svetal99 fr3etMicrosoft Word 10.0@˜о @цЋGwйФ@”ыmйФ@,okwйФЈs ўџеЭеœ.“—+,љЎ0 hp€ˆ˜  ЈАИ Р §щ§КкСЯЭј-CH A 1Preparing frozen stock of competent DH5яЁ cells Title ўџџџўџџџ !"#$ўџџџ&'()*+,ўџџџ./01234ўџџџ§џџџ7ўџџџўџџџўџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџRoot Entryџџџџџџџџ РF`5>owйФ9€Data џџџџџџџџџџџџ1TableџџџџWordDocumentџџџџ"(SummaryInformation(џџџџџџџџџџџџ%DocumentSummaryInformation8џџџџџџџџ-CompObjџџџџџџџџџџџџjџџџџџџџџџџџџўџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџџўџ џџџџ РFMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.8є9Вq